究的中制备高压纽莫康定二试研

2.3高压制备方法的高压确定

初始方法为鲁南新时代生物技术有限公司在50mm高压制备液相(汉邦科技，制备型液相色谱系统，制备中试NS4000)上开发，纽莫是康定以二氯甲烷、甲醇和水体系制备纽莫康定B₀，研究国内外未见具体报道。高压张宇等采用了氯仿、制备中试甲醇和水体系，纽莫笔者以二氯甲烷进行实验，康定毒性低于氯仿，研究价格也低于氯仿，高压放大生产具有一定的制备中试优越性。初始方法：将纽莫康定B₀粗品(质量分数为81.2%，纽莫HPLC检测如图1所示，康定纽莫康定B₀的研究色谱纯度为88.58%、纽莫康定C₀的色谱纯度为8.78%)用甲醇、二氯甲烷混合溶液(V(甲醇)∶V(二氯甲烷)=1∶4)溶解，波长276nm；柱温20～30℃；流量70mL/min；上样量1.7g；流动相，V(二氯甲烷(工业))∶V(甲醇)∶V(水)=43∶9∶1；操作压力5～5.5MPa。收集B₀的HPLC色谱纯度>95%的制备液。纽莫康定B₀的色谱纯度值和纽莫康定C₀的色谱纯度值是经过面积归一化法得到的。以线性原则放大到中试150mm制备柱(Cs-prep150工业制备色谱系统，汉邦科技)，流量调整为630mL/min；进样量15.3g；其他不变。在此基础上，对该方法进行了进一步优化。

2.3.1流动相比例的优化

根据正相色谱特点，通过调控二氯甲烷，对流动相比例进行优化。在初始方法中，实验分析了V(二氯甲烷(工业))∶V(甲醇)∶V(水)的5个比例对纽莫康定B₀制备分离的影响，实验结果如表2所示。

由表2可知：随着二氯甲烷比例的增加，纽莫康定B₀峰的保留时间逐渐增加，B₀峰分离度逐渐增大，B₀峰和相邻峰的重合越小。其中，41∶9∶1和42∶9∶1的流动相比例相比，后者B₀分离度高于前者，且B₀峰型较好，保留时间相差不大。保留时间越长，生产成本越大。综合考虑B₀的分离效果和生产成本，故选择V(二氯甲烷(工业))∶V(甲醇)∶V(水)=42∶9∶1。

2.3.2上样量的优化

上样量在色谱制备中影响着目的峰的分离度及制备效率。因此，在流动相比例确定为V(二氯甲烷(工业))∶V(甲醇)∶V(水)=42∶9∶1的基础上，实验选取了3种进样量(7.5，11.4，15.3g)对纽莫康定B₀制备的效果进行研究，实验结果如表3所示。

上样量越大，分离度越小。对不同上样量下的B0峰进行分段收集，并对B0的HPLC色谱纯度大于95%的料液进行合并、减压浓缩和冻干，得到冻干粉的质量分别为3.01，4.7，4.8g。3种冻干粉B₀质量分数分别为95.73%，95.77%，95.63%，相差不大。计算收率分别为47.31%，48.63%，36.95%，其表达式为

式中：X为上样液对应粗品质量；Y为粗品B0质量分数。

由表3可知：上样量11.4g收率高于上样量7.5，15.3g。收率高，则在中试、大生产中预示着低成本、高效益，以及制药企业在市场中较高的竞争力。因此，综合考虑对纽莫康定B₀的分离效果和收率，选择11.4g上样量。

2.3.3洗脱流速的优化

在高压制备液相色谱中，洗脱流速影响柱压、峰型，进而影响到制备效率及效果。故在确定流动相比例V(二氯甲烷(工业))∶V(甲醇)∶V(水)=42∶9∶1及上样量11.4g的基础上，考察了5个洗脱流速(480，530，580，630，680mL/min)对纽莫康定B₀制备的影响，结果如表4所示。

由表4知：洗脱流速越大，柱压越高，峰型越窄。对不同洗脱流速下的B₀峰进行分段收集，并对B₀的HPLC色谱纯度大于95%的料液进行合并、减压浓缩和冻干。流速越大，得到的洗脱合并液体积逐渐减小，且减小幅度不大。最终得到的冻干粉质量分别为4.71，4.70，4.72，4.73，4.72g，其各数值相差很小。

随着流速的增加，柱压逐渐增加，而实验所用150mm高压制备系统工作压力为0～7MPa。随着进样次数的增加，柱压会逐渐增高，再生柱子会越频繁，如此会占用一定的工时和消耗再生溶剂，增加生产成本。另外，在5个流速下，冻干粉的收率和B0质量分数相差不大。综上考虑，优选480mL/min的流速作为150mm的制备柱流速。

2.4纽莫康定B0的高压色谱制备

以优化后的高压制备条件，在150mm制备柱上进行纽莫康定B₀的制备。对B₀峰分段收集，连续进样，合并纽莫康定B₀的HPLC色谱纯度大于95%的制备液。将合并液进行减压浓缩，冻干，得到纽莫康定B₀冻干粉。

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